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PHYSIOLOGIE DE LHEMOSTASE  I - INTRODUCTION Lhémostase est lensemble des mécanismesqui concourent à maintenir le sang à létat fluide à lintérieur des vaisseaux. Le processus dhémostase, qui vise donc à arrêter les hémorragies etempêcher les thromboses se déroule classiquement en tro...  
PHYSIOLOGIE DE LHEMOSTASE  I - INTRODUCTION Lhémostase est lensemble des mécanismesqui concourent à maintenir le sang à létat fluide à lintérieur des vaisseaux. Le processus dhémostase, qui vise donc à arrêter les hémorragies etempêcher les thromboses se déroule classiquement en trois temps :- lhémostase primaireferme la brèche vasculaire par un "thrombus blanc" (clouplaquettaire),- la coagulationconsolide ce premier thrombus en formant un réseau de fibrine emprisonnant desglobules rouges (thrombus rouge),- la fibrinolyse,processus limitant, permet la destruction des caillots, ou la limitation deleur extension. Ces trois temps sont initiés simultanément dès quest enclenché leprocessus dhémostase.  II - HEMOSTASE PRIMAIRE Immédiatement déclenchée dès quil y a une brèche vasculaire, elleaboutit à larrêt du saignement essentiellement pour les petits vaisseaux.  A – Les acteurs en présence Quatre éléments principaux sont impliqués dans lhémostaseprimaire :  -deux éléments cellulaires : cellules endothéliales et plaquettes  -deux éléments plasmatiques : facteur von Willebrand et fibrinogène 1 - Endothélium et paroi vasculaireToutes les parois vasculaires de lorganisme sont construites sur unschéma identique comportant successivement, de la lumière du vaisseau vers lapériphérie, trois couches : l’intima, la média et l’adventice (Fig 1).  Fig1: Structure de la paroi vasculaire   -Lintima est faite dune couche continue monocellulaire de cellulesendothéliales séparée du sous endothélium par la membrane basale.  La membrane basale est faite de collagène et joue le rôle de"tamis" moléculaire, les cellules endothéliales reposent dessus. Lesous-endothélium comporte des microfibrilles constituées dun autre type decollagène. Il est très thrombogène. Les cellules endothéliales tapissent lensemble des vaisseaux. Ellesont des fonctions multiples.  1- En sinterposant de façon ininterrompue entrele sang et les substances sous-endothéliales procoagulantes, elles préviennentlactivation de la coagulation et des plaquettes. A l’état de repos, lescellules endothéliales sont antithrombotiques.2- Elles constituent en outre un filtre sélectifpuisque des cellules et des substances diverses peuvent sortir de lendothéliumen passant entre les cellules endothéliales, dautres substances peuventtransiter à travers la cellule endothéliale par des réseaux de canaux par unmécanisme de pinocytose. 3- Par contre lorsquelles sont activées, ellesdeviennent prothrombotiques et seront le support des réactions aboutissantà la coagulation du sang. 4- Enfin ces cellules sont douées de propriétés desynthèse extrêmement importantes : elles synthétisent des facteurs impliquésdans lhémostase : facteur Willebrand, prostacycline (PGI2), facteurtissulaire, thrombomoduline, activateur du plasminogène (tPA) et son inhibiteur(PAI). 5- Les cellules endothéliales sont égalementimpliquées dans des phénomènes autres que lhémostase: phénomènes immunitaires(cellules présentatrices de lantigène, synthèse de facteur de croissancehématopoïétique...). Lintima est séparée de la média par la limitante élastique interne.    - Lamédia est plus ou moins développée suivant le type de vaisseaux (parexemple, lartère comporte une média importante). La média est riche en fibresmusculaires qui permettent la vasoconstriction et en fibroblastes. Elle estséparée de ladventice par la limitante élastique externe.     - Ladventicefera le lien avec les autres structures tissulaires péri-vasculaires. Dansladventice circulent les vasa vasorum et se terminent les ramificationsnerveuses.  2 - Plaquettes Les plaquettes sont les plus petits éléments figurés du sang. Ellescirculent à létat non activé. De lextérieur vers lintérieur elles comportent:   -une membrane composée dune double couche de phospholipides (PL)sopposant par leur pôle hydrophobe (Fig.2). Une propriété importante de lamembrane est la répartition asymétrique des PL notamment de l’und’entr’eux : la phosphatidylsérine. Les phospholipides anioniques sont prédominantsà lintérieur de la plaquette et seront externalisés lors des étapesd’activation plaquettaires. On se rappellera aussi de la richesse en acidearachidonique de la membrane. Dans cette membrane sont implantées desglycoprotéines dont les principales sont la glycoprotéine IIb IIIa et laglycoprotéine Ib. Cette membrane est riche en récepteurs divers, le plusimportant dans la physiologie plaquettaire étant le récepteur à la thrombinerécemment individualisé. Fig2: La membrane plaquettaireDoublecouche de phospholipides et glycoprotéines Sous la membrane plaquettaire on trouve un réseau musculo-squelettiquefait de micro fibrilles composées dactine et de myosine qui constituent unevéritable musculature pour la plaquette douée de mouvements propres et unsquelette fait de micro tubules qui contribuent à maintenir la forme discoïdede la plaquette.    - A lintérieur des plaquettes on trouve, dans lecytoplasme, deux réseaux de canaux : · le système canaliculaire ouvert, fait de profondes invaginations de la membrane plaquettaire,permettant une communication rapide entre des éléments extra cellulaires etlintérieur des plaquettes· le système tubulaire dense, lieu de stockage du calcium. Les échanges de calcium entre lecytoplasme plaquettaire et le système tubulaire dense sont indispensables àlactivation plaquettaire.   Dansle cytoplasme on reconnaît également des granulations de trois types :  · granules densescomportant de lATP, de lADP, de la sérotonine et du calcium,· granules alpha comportantdu facteur 4 plaquettaire, de la beta thromboglobuline, du facteur Willebrandet de très nombreuses autres substances,· grains lysosomiauxfaits denzymes très divers (hydrolases, phosphatases).Ces produits stockés seront libérés par les plaquettes sur le lieu oùse déroule le processus dhémostase, permettant dobtenir très rapidement desconcentrations très importantes des ces différents composants.Enfin on trouve dans la plaquette des grains de glycogène et desmitochondries.  3 - Facteur von Willebrand (vWF) Il sagit dun polymère hétérogène composé de multimères de poidsvariable (0,5 à 15 x 10 6 Daltons). Le facteur Willebrand estsynthétisé par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes. Il est présentdans le plasma, les plaquettes et le sous-endothélium. Dans le plasma, ilcircule lié au facteur antihémophilique A (facteur VIII). Le facteur Willebrandprotège le facteur VIII, qui est un facteur labile, contre la protéolyse. Unediminution importante du facteur Willebrand entraînera donc une diminution dufacteur VIII.  4 - Fibrinogène Cette molécule est un dimère. Chaque monomère est composé de troischaînes (alpha, bêta, gamma). La molécule du fibrinogène comporte un domainecentral E et deux domaines latéraux D. Le fibrinogène interviendra danslhémostase primaire mais aussi dans la coagulation.  B – Le déroulement de l’hémostase primaire Dès quune brèche vasculaire se constitue, le processus dhémostaseprimaire se met en jeu. 1 - Le temps vasculaire : La premièreréaction de lorganisme est une vasoconstriction localisée qui peut soitarrêter les hémorragies, soit au moins réduire le flux sanguin et modifier lesconditions hémodynamiques, favorisant le processus dhémostase (concentrationélevée de cellules et de substances du fait de la réduction de la lumièrevasculaire, modification du régime découlement avec perte de lécoulementlaminaire, ce qui, du fait des turbulences générées, favorisera lesinteractions moléculaires et cellulaires). 2 - Ladhésion plaquettaire : Lesplaquettes dès leur sortie du vaisseau adhèrent à la structure sousendothéliale mise à nu par la brèche vasculaire. Ladhésion se produit engrande partie par la glycoprotéine Ib qui se colle au sous endothélium grâce aufacteur Willebrand qui sert de ciment. Une première couche monocellulaire deplaquettes se constitue ainsi. Les plaquettes adhérentes sactivent etrecrutent dautres plaquettes circulantes.  3 - Lagrégation plaquettaire : Sur lapremière couche de plaquettes se fixent dautres plaquettes. Les glycoprotéinesIIbIIIa de surface, lors de lactivation plaquettaire subissent unemodification conformationnelle qui leur permet de fixer le fibrinogène enprésence de calcium. L’agrégation plaquettaire se fait ainsi grâce aufibrinogène qui établit des ponts entre les plaquettes, créant un premierthrombus fragile. On dit que lagrégation est réversible. Grâce à la libérationdes enzymes et du contenu granulaire des plaquettes, le caillot se solidifie :on parle dagrégation irréversible, ce qui va constituer le thrombus blanc ouclou plaquettaire (Fig. 3). 4 - Les fonctions procoagulantes plaquettaires : La phosphatidylsérine est un phospholipide localisé à lintérieur de lamembrane plaquettaire au repos. Après activation, la phosphatidylsérine estexternalisée. Elle va servir de support et de surface de catalyse aux réactionsde coagulation.  Fig3: Déroulement de l’hémostase primaire   III - COAGULATION Le thrombus plaquettaire est fragile. Il doit donc être consolidé etformera le thrombus rouge résultat des processus de la coagulation. Lacoagulation comme lhémostase primaire met en jeu des cellules et des facteursplasmatiques.    A - Cellules et facteurs    1- Eléments cellulaires   Lacoagulation ne peut se dérouler sans la présence de cellules ou de substancesoriginaires de ces cellules. Les cellules les plus importantes dans lacoagulation sont les cellules endothéliales, les monocytes et les plaquettes.   Lescellules endothéliales stimulées par des cytokines ou des facteurs physico-chimiques,expriment à leur surface une protéine, le facteur tissulaire, qui est associéeà des phospholipides membranaires. Ce facteur tissulaire anciennement appeléthromboplastine tissulaire est lélément déclenchant et le support majeur de lacoagulation. Des cellules circulantes, les monocytes, sont également capablesdexprimer le facteur tissulaire sous linfluence de cytokines (IL1, TNF) voiredendotoxine bactérienne ou de certains antigènes.   Lesplaquettes interviennent aussi dans la coagulation. Lorsque la plaquette estactivée, les phospholipides anioniques membranaires sont externalisés etserviront de support à la coagulation Enfin les plaquettes (tout comme lesmonocytes) peuvent libérer dans le milieu plasmatique de petits fragments de membraneappelés microvésicules capables elles aussi de supporter le phénomène decoagulation et donc de lamplifier.   Dautrescellules peuvent jouer un rôle dans la coagulation : les fibroblastes sontcapables dexprimer le facteur tissulaire; ils synthétisent tout comme lescellules musculaires beaucoup de facteurs impliqués dans la coagulation.    2 - Eléments non cellulaires: facteurs de coagulation etleurs inhibiteurs   Lesfacteurs de coagulation sont des pro-enzymes toutes synthétisés par lhépatocyte.Ceci explique les désordres hémorragiques chez les cirrhotiques ou lespersonnes atteintes dune insuffisance hépato-cellulaire. Le facteur VIII faitexception à cette règle : son taux reste normal ou augmenté.   Ilexiste toujours au moins 2 formes pour ces facteurs: une forme non active(exemple facteur VII: proconvertine, facteur II: prothrombine) et une formeactive (exemple facteur VIIa: convertine, facteur IIa: thrombine). Aucun de cesfacteurs na de substrat spécifique. Chaque facteur à létat activé pourra soitactiver un autre facteur soit modifier certaines protéines impliquées ou nondans la coagulation. Le seul substrat vrai de la coagulation sera en fait lefibrinogène. L’ensemble de ces facteurs est repris dans le tableau 1.   Certainsde ces facteurs portent des résidus gamma-carboxylés qui leur permettent defixer le calcium et de se lier aux membranes phospholipidiques. Il sagit desfacteurs II, VII, X, IX (habituellement désignés par PPSB du nom de leursinitiales : Prothrombine, Proconvertine, facteur Stuart, facteurantihémophilique B), et de certains inhibiteurs: protéine C, protéine S. LaGamma-carboxylation nécessite la présence de vitamine K doù le nom de facteurvitamine K dépendant. Ainsi, un patient porteur dune avitaminose K ou recevantun traitement appelé antivitamine K aura une diminution de synthèse de cesfacteurs. A la place circulent des substances appelées PIVKA (ProteinInduced by Vitamine K Absence ou Antagoniste): PIVKA VII, PIVKA II, PIVKAX, PIVKA IX : ce sont des précurseurs non carboxylés donc inactifs car leurliaison aux phospholipides en présence de calcium est impossible.    N° Facteur  Nom  Particularité  Demi-vie  Taux mini  nécessaireFacteurI  Fibrinogène  Absentdu sérum  4-6 jours  0,5à 1 g/lFacteur II  Prothrombine  VitK dépendant  3-4 jours  40%  5 % dans sérumFacteurV  Proaccélérine  Absentdu sérum  12-36 h  10-15%Facteur VII  Proconvertine  VitK dépendant  4-6 h  5-10%Facteur VIII  Anti-hémophA  Absentdu sérum  10-16 h  30-40%Facteur IX  Anti-hémophB  VitK dépendant  24 h  30-40%Facteur X  Stuart  VitK dépendant  1-2 jours  10-20%Facteur XI  Rosenthal  1-2jours  30%Facteur XII  Hageman  2-3jours  0% ?Facteur XIII  Stabilisantfibrine  3-7jours  2% TableauI: Les facteurs de coagulation    Acôté de ces facteurs existent dans le plasma des systèmes inhibiteurs : systèmedes anti-thrombines, système protéine C- protéine S, inhibiteur de la voieextrinsèque (TFPI pour Tissue Factor Pathway inhibitor). Ils sont prédominantsdans le plasma et régulent en permanence le processus dhémostase.   B - Déroulement du processus decoagulation in vivo La coagulation est une cascade de réactions enzymatiques. Lenzyme quipermet de transformer le fibrinogène en fibrine est la thrombine.Son processus de formation est complexe. Il comprend une série dactivationsenzymatiques en cascade qui surviennent à la surface des phospholipidesmembranaires de certaines cellules (plaquettes, cellules endothéliales,monocytes).  1 - La conception classique du phénomènede coagulation comportait 2 voies dactivation   La voie intrinsèque dans laquelle tous les élémentsnécessaires de la coagulation sont présents dans le plasma sans apportextérieur. Cette voie sactive en présence de surface mouillable comme leverre.la voie extrinsèque qui pour être activéenécessite la présence déléments tissulaires appelés thromboplastinetissulaire. Le déroulement de la coagulation in vivo ne respecte pas cettedistinction voie intrinsèque - voie extrinsèque. Cette conception duelle de lacoagulation correspond en fait aux processus de coagulation in vitro etsera très utile pour l’exploration de la coagulation car la voie intrinsèque(ou endogène) et la voie extrinsèque (ou exogène) sont respectivement exploréespar le temps de céphaline activée et le temps de Quick. Cest donc sur ceschéma que pourra se faire le raisonnement diagnostique dinterprétation destests de coagulation bien que ce schéma ne correspond pas à la réalité invivo. 2 - Conceptionactuelle de la coagulation in vivo    a)Le déclenchement de la coagulation   Ilest admis que lélément déclenchant de la coagulation in vivo estlexpression à la surface des cellules (monocytes, cellules endothéliales voirefibroblastes) de facteur tissulaire. Le facteur tissulaire est un récepteurmembranaire de très haute affinité pour le facteur VII. Il est normalementabsent de la circulation sanguine mais est exprimé au niveau des cellulesmusculaires lisses de la paroi vasculaire et des fibroblastes de façonconstitutive. Certains tissus sont très riches en facteur tissulaire : tissucérébral par exemple. Ainsi, Lors dune brèche vasculaire ou lors delexpression pathologique du facteur tissulaire par certaines cellulessanguines, ce dernier fixe le facteur VII circulant qu’il active formant uncomplexe: [facteur VII activé - facteur tissulaire].   Ilexiste une toute petite quantité préalable de facteur VII déjà activé dans leplasma mais qui en l’absence de facteur tissulaire a très peu d’activitéenzymatique. A partir de la formation du complexe, deux voies dactivation sontpossibles (Fig.4): Quand le facteur tissulaire est en excès, le complexe [facteur VIIactivé - facteur tissulaire]. active directement le facteur X. Cette voie peutcependant être rapidement inhibée par l’inhibiteur de la voie du facteurtissulaire, le TFPI.Quand le facteur tissulaire est en faible quantité (ou linhibition parle TFPI prépondérante), le complexe [facteur VII activé - facteur tissulaire]active alors le facteur IX. Laccumulation de facteur IX activé en présence deson cofacteur le facteur VIII activé, de phospholipides et dions calcium(complexe antihémophilique) permettra secondairement lactivation du facteur Xen facteur X activé.Le facteur IX ou facteur antihémophilique B et le facteur VIII oufacteur antihémophilique A sont deux facteurs extrêmement importants enpathologie.  Fig4 : Le rôle du facteur tissulaireLafixation du facteur VII au facteur tissulaire permet l’activation du facteurVII. Le facteur VII activé peut soit activer directement le facteur X (si lefacteur tissulaire est en excès), soit activer le facteur IX qui en présence defacteur VIII activera le facteur X.  b)La thrombinoformation   Quelleque soit la voie empruntée in vivo, le point central sera la générationde facteur X activé. Le facteur X activé en présence de facteur V activé, dephospholipides des membranes cellulaires, et de calcium, sappelle le complexeprothrombinase. Le complexe prothrombinase active la prothrombine (facteur II)en thrombine (facteur IIa). La thrombine est une enzyme extrêmement puissante. Son principal substrat est le fibrinogène. Une molécule de thrombinepeut coaguler 1 000 fois son poids de fibrinogène. La thrombine, outre son actionsur le fibrinogène, catalyse sa propre génération : la thrombine favoriselactivation du facteur VIII en facteur VIII activé, de facteur V en facteur Vactivé et de facteur XI en facteur XI activé (voir rôle du système contact)(Fig 6). Elle active également le facteur XIII qui va jouer un rôle majeur dansla stabilisation du caillot.   c)La fibrinoformation   Dèsquapparaissent des traces de thrombine, le processus de coagulationsamplifie. La thrombine casse le fibrinogène en libérant 2 petits peptides :fibrinopeptide A et fibrinopeptide B. En perdant le fibrinopeptide A puis lefibrinopeptide B, le fibrinogène devient la fibrine. Spontanément, lesmonomères de fibrine peuvent se polymériser et former un premier réseau oupolymère soluble de fibrine. Ce polymère est instable. Il sera stabilisé par undernier facteur, le facteur XIII (facteur stabilisant la fibrine: FSF). Lefacteur XIII crée des liaisons covalentes solides entre ces monomères defibrine. On a alors formation dun réseau de fibrine qui emprisonne lesglobules rouges : le thrombus rouge définitif est ainsi formé (Fig 5). Fig5 : La fibrinoformationLathrombine (FIIa) clive deux petits peptides (fibrinopeptides A et B) sur lamolécule de fibrinogène, libérant des sites de liaison. Cette molécule defibrinogène modifiée est alors appelée monomère de fibrine et va pouvoirs’organiser en réseau dans les différents plans de l’espace. Ce réseau defibrine sera stabilisé par des liaisons covalentes générées par le facteur XIIIactivé.   d)Le rôle du système contact    Dansle schéma actuel de la coagulation in vivo, le système contact paraitjouer un rôle limité. Le système contact est composé de 4 facteurs : le facteurXII, la prékallicréine, le kininogène de haut poids moléculaire et le facteurXI. Lactivation du système contact peut être déclenchée par le contactdu facteur XII avec une surface chargée négativement mouillable ou certainscomposés biochimiques. Un déficit même complet en lun des 3 premiers facteurs: XII, prékallicréine, kininogène de haut poids moléculaire, entraîne desallongements très importants du temps de céphaline activé sans hémorragie. Ceséléments ne paraissent donc pas indispensables à la coagulation in vivo.En revanche, les déficits en facteur XI peuvent saccompagner de syndromeshémorragiques en particulier lors dintervention sur la sphère ORL ou le petitbassin. Ceci est dû au fait que le facteur XI participe à la coagulation par àune boucle de rétro-activation : lamplification du phénomène de coagulation sefait grâce à la thrombine qui active le facteur XI en XI activé. Lors dedéficit en facteur XI, cette boucle ne fonctionne plus et ceci explique enpartie les syndromes hémorragiques (Fig. 6).   Fig6 : Coagulation in vivo, rôle central de la thrombineLathrombine est à l’origine de plusieurs boucles de rétro-activation amplifiantsa propre génération. 3 - Rôle du calcium Cet électrolyte est indispensable à la coagulation.   Cettepropriété est utilisée lors des prélèvements sanguins : Pour éviter lacoagulation du sang dans le tube, il suffit de prélever sur un chélateur ducalcium (EDTA, citrate). Pour l’étude de l’hémostase, le prélèvement doit êtreeffectué sur l’anticoagulant de référence: le citrate 0,109 M.  Onpeut ensuite centrifuger ou simplement laisser sédimenter les élémentscellulaires. Le surnageant est le plasma. Le plasma par définition comprendtous les facteurs de coagulation. Les tests de coagulation effectués aulaboratoire sont réalisés sur le plasma. Par contre en présence de calcium etdun activateur de la coagulation (facteur tissulaire ou surface mouillable),le sang coagule. Si l’on élimine le caillot, il reste non plus du plasma maisdu sérum : le sérum diffère du plasma par labsence de certains facteurs decoagulation qui sont complètement consommés lors de la coagulation. Les facteursconsommés sont le fibrinogène (facteur I), le facteur V et le facteur VIII.Le sérum est incoagulable, il ne peut donc pas être utilisé pour faire desexamens de coagulation (sauf le test de consommation de la prothrombine, seréférer à l’exploration de l’hémostase).  C- Régulation de lacoagulation : le rôle des inhibiteurs (Fig. 7) Le système de la coagulation plasmatique a tendance à sactiverspontanément. Il est très important pour lorganisme que les enzymes forméslors de lactivation de la coagulation (thrombine, facteur Xa) ne circulent pasdans le plasma car ils risqueraient dentraîner une activation diffuse de lacoagulation et un processus pathologique grave. Pour éviter ceci et maintenirleur équilibre, chaque facteur activé a son inhibiteur. On connaît troissystèmes inhibiteurs :  le système de lantithrombine, le système ProtéineC-Protéine S, et le TFPI (voir ci-dessous).   1-lantithrombine (anciennementappelée antithrombine III: ATIII) inhibe principalement le facteur II activé outhrombine mais aussi le facteur X activé, le facteur IX activé et partiellementle facteur XI activé. Son activité anticoagulante est augmentée de façon trèsimportante par un produit utilisé en thérapeutique, lhéparine. Les déficits en antithrombine sont des maladies sévères responsables dethromboses à répétition (thromboses veineuses, embolies pulmonaires).Il existe un autre inhibiteur de la thrombine dont limportancephysiologique est peu connue et probablement minime : le second cofacteurde lhéparine.   2-le système Protéine C-Protéine S : La protéine C(PC) circule sous forme inactive. Elle peut être activée par la thrombine enProtéine C activée (PCa) à condition que la thrombine soit fixée sur unrécepteur appelé la thrombomoduline. La PCa est un inhibiteur très puissant desfacteurs Va et VIIIa. Son action est augmentée par une autre substancecirculant dans le sang, la Protéine S (PS). Il est intéressant de noter que laPC et la PS sont des facteurs vitamine K dépendants. Il existe des déficits enPC et PS exposant les sujets atteints à un risque de thrombose. Dans les substrats de la PCa, le plus important paraît être le facteurVa. Certains individus présentent une anomalie du facteur V qui rend le facteurVa insensible à laction neutralisante de la PCa : on parle de résistance à laProtéine C activée (RPCA). Cette anomalie est très fréquente (~ 3 % de lapopulation dans le Sud de la France). Elle est associée à une anomaliemoléculaire sur le gène du facteur V appelé facteur V Leiden (ou mutationR506Q). Les sujets porteurs de cette mutation ont un risque augmenté dethromboses veineuses.   3-le TFPI (tissue factor pathway inhibitor): On a longtemps cherché quel pouvait être linhibiteur du facteur VIIactivé. Il ny a pas dinhibiteur du facteur VII activé mais un inhibiteurappelé TFPI qui inhibe lactivation du facteur X par le complexe [facteur VIIactivé – facteur tissulaire]. Ceci explique que, dans le plasma, circule un peude facteur VII activé.     Fig7: Les inhibiteurs de la coagulationIl ya 3 systèmes inhibiteurs principaux:l’antithrombine(ATIII), le système protéine S - protéine Cetl’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI)   IV - LA FIBRINOLYSE    Lafibrinolyse est le troisième temps de lhémostase. Sa finalité est linverse decelles de lhémostase primaire et de la coagulation qui visaient à former lecaillot. La fibrinolyse tend à empêcher linstallation mais surtout lextensiondu caillot en détruisant les polymères de fibrine. Lorsque le caillot estformé, la fibrinolyse physiologique peut le reperméabiliser.  A - Les acteurs de lafibrinolyse 1 - Facteurs plasmatiques   Lafibrinolyse fait intervenir une substance circulant sous forme inactive dans leplasma: le plasminogène, synthétisé par le foie. Sous linfluencedactivateurs, le plasminogène se transforme en plasmine qui est uneenzyme protéolytique très puissante, capable de dégrader le caillot de fibrinemais aussi de détruire le fibrinogène, voire dautres facteurs de coagulation.  Lactivation du plasminogène en plasmine se fait grâce à desactivateurs de deux types:  - lavoie de l’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA). Cette substanceest synthétisée de façon quasi exclusive par la cellule endothéliale qui lalibère sur le site du caillot lors de tout phénomène dagression.  - lavoie de la pro-urokinase-urokinase (U-PA) La forme circulante estla pro-urokinase synthétisée par les cellules rénales et dautres cellulesparenchymateuses. La pro-urokinase sactive en urokinase essentiellement aucontact du caillot de fibrine. Il est intéressant de noter que le systèmecontact (facteur XII et kallicréine) peuvent activer la pro-urokinase. Le système fibrinolytique est régulé par deux typesd’inhibiteurs :  -inhibiteurs de la plasmine : alpha 2 antiplasmine, alpha 2macroglobuline  -inhibiteurs des activateurs du plasminogène : le PAI-1 est linhibiteursurtout du t-PA et le PAI-2, présent essentiellement chez la femmeenceinte, est inhibiteur de lurokinase. Il a été décrit aussi un PAI-3 dont lerôle physiologique est difficile à déterminer et dautres inhibiteurs desurface cellulaire.  2 - Elémentscellulaires   Ilsagit en particulier des monocytes et des cellules endothéliales qui dunepart synthétisent des facteurs activateurs (tPa) ou inhibiteurs de lafibrinolyse (PAI) mais dautre part, portent à la surface ou peuvent exprimer lorsquellessont activées des récepteurs pour le plasminogène ou les activateurs duplasminogène, ou bien des inhibiteurs. Ainsi le processus de fibrinolyse serabeaucoup plus efficace lorsque des éléments cellulaires sont présents, etquils permettent dobtenir des concentrations dactivateur ou dinhibiteurtrès importantes in situ.   B – Le déroulement   Leplasminogène circulant est une proenzyme, inactive donc. Le t-PA circule lié àson inhibiteur, le PAI-1. Il est ainsi, lui aussi, inactif. De même, lapro-urokinase circulante est peu active en labsence de fibrine. Dès que seforment des traces de fibrine, la cellule endothéliale libère du t-PA parfoisen quantité très importante. Cette libération est favorisée par lhypoxie, parla stase, par lacidose ou par certaines cytokines. Le t-PA a une forteaffinité pour la fibrine sur laquelle il va se fixer. Lactivation duplasminogène en plasmine par le t-PA se fera donc uniquement sur le caillot defibrine, et non pas dans le courant plasmatique. De même la présence de fibrineva favoriser lactivation de pro-urokinase en urokinase. Ceci est amplifié parla génération, au niveau du caillot, de facteurs de la coagulation activés. Lesmonocytes, activés par différentes cytokines, (interleukine 1, TNF) expriment àleur surface différents récepteurs dont le récepteur à lurokinase. En fixantlurokinase, ils participeront à la destruction du caillot de fibrine.Lorsquun excès de plasmine est généré, cette enzyme passe dans le courantplasmatique où elle est aussitôt neutralisée par les inhibiteurs de la plasmine: alpha 2 antiplasmine, alpha 2 macroglobuline. Ceci contribue à localiser leprocessus de fibrinolyse au niveau du caillot de fibrine.  Auniveau du caillot, la plasmine génère des fragments très hétérogènes à partirde la fibrine, appelés PDF (Produits de Dégradation de la Fibrine).Certains PDF sont spécifiques de la fibrine : ces fragments portent tousla structure D-D doù le nom de D-Dimères (Fig 8). Fig8 : Coagulation et fibrinolysePDF :Produits de dégradation de la fibrine et du fibrinogène.  V - SYNTHESE Le processus dhémostase primaire et de coagulation aboutit à laformation dun caillot alors que la fibrinolyse tend à le détruire. Il y a doncun équilibre permanent entre dun côté lhémostase primaire et la coagulationet dun autre côté la fibrinolyse. Cet équilibre sappelle la balancecoagulolytique. Une hémorragie peut être due soit à un défaut de lhémostase primaire(thrombopénie : diminution du taux de plaquettes ; thrombopathie :altération des fonctions plaquettaires), soit à une coagulopathie (absence dunou plusieurs facteurs de coagulation), soit à un excès de fibrinolyse (excèsdactivation ou défaut dinhibiteurs). Une thrombose peut être due à une activation excessive de lacoagulation favorisée par un déficit des inhibiteurs de la coagulation.Théoriquement, les hypofibrinolyses peuvent être aussi responsables dethrombose. Récemment les excès de facteurs de la coagulation notamment de FVIIIont été décrits comme favorisant le risque de thrombose veineuse. Il est intéressant de constater que des cellules voire des moléculesont une certaine dualité dans lhémostase: ainsi la cellule endothélialeparticipe à lhémostase primaire par la synthèse de facteur Willebrand etlinhibe par la synthèse de prostacycline. Elle peut activer la coagulation enexprimant à sa surface du facteur tissulaire mais peut aussi linhiber enexprimant de la thrombomoduline. De même pour la fibrinolyse, elle synthétiseun activateur, le t-PA et son inhibiteur: le PAI-1. Cette dualité se retrouve,curieusement, sur certaines molécules: ainsi la thrombine est lenzyme clé dela coagulation: cest elle qui transforme le fibrinogène en fibrine, et nousavons vu aussi, qui amplifie sa propre génération par des boucles derétro-activation. A lopposé, la thrombine, en présence de thrombomoduline, active la protéine C et se comporte donc comme un anticoagulant.   EXPLORATIONDE LHEMOSTASE  I –DESCRIPTIONDES TESTS D’HEMOSTASE Létude de lhémostase est extrêmement importante en clinique. Lestests dhémostase sont utilisés :1- pour le diagnostic étiologique dun syndromehémorragique, ou pour essayer d’évaluer un risque hémorragique avant uneintervention chirurgicale,2- dans le cadre de thromboses à répétition, pourdéterminer la cause de ces maladies invalidantes et graves puisque certainespeuvent entraîner la mort par embolie pulmonaire. On ne dispose daucun test global détude de lhémostase: on aura donc recours à des tests qui exploreront soit lhémostaseprimaire, soit la coagulation, soit la fibrinolyse. 1 - Tests explorant lhémostase primaire a) Le temps de saignement Le temps de saignement est le temps darrêt de lhémorragie dune plaiecutanée superficielle. Deux méthodes sont possibles :   - lune consiste à faire une incision à loreilleavec un vaccinostyle et à mesurer le temps darrêt du saignement. En moyenne ilest de 2 à 4 min (test de Duke). Ce test ne doit plus être pratiqué.- la seconde méthode consiste à mettre un garrot au brasgonflé à une pression de 4 cm de mercure et à faire une incision horizontale àlavant-bras avec un appareil spécial jetable. Le saignement sarrête en 4 à 8min. Cette méthode sappelle Ivy. Cest la plus sensible et la seule qui doitêtre utilisée en pratique. Le temps de saignement apporte un certain nombre de renseignements maisil nest pas infaillible. Il peut être perturbé par des erreurs techniques :  - incision trop profonde qui donne un fauxallongement du temps de saignement,  -incision trop superficielle qui au contraire donne un temps trop court.En outre le temps de saignement est allongé par la prise récente decertains médicaments en particulier laspirine. Il est donc indispensable debien interroger les patients avant de faire un temps de saignement. Il peutêtre allongé dans les maladies de lhémostase primaire (thrombopathie,thrombopénie, maladie de Willebrand). En pratique cet examen, vulnérant et imprécis a peu dintérêt et estsouvent prescrit inutilement. Il ne peut en aucun cas être considéré commeun examen de dépistage du risque hémorragique mais peut sinscrire dans unedémarche diagnostique à condition de bien en poser les indications.   b) La numération plaquettaire Cet examen est capital. Il fait partie de tout bilan sanguin. Lesappareils automatiques sont actuellement dune grande reproductibilité. Lestaux normaux de plaquettes sont de 150 à 400 x 109/l (150 à 400 000/ mm3 ou 150 à 400 Gigas/l)Il faut savoir néanmoins quil existe de fausses thrombopénieslorsquil y a agrégation des plaquettes dans le tube, ce qui se produit lorsquele prélèvement a été mal fait (présence de micro caillots qui consomment desplaquettes). En outre, une circonstance à connaître est le fait que chezcertain individus, il existe une agrégation des plaquettes en présence dEDTA,anticoagulant utilisé dans les tubes à hémogramme. Toute thrombopéniedoit donc être vérifiée sur un prélèvement effectué sur tube citraté ouhépariné.Après cette vérification, un chiffre de plaquettes inférieur à 150000/mm3 correspond à une thrombocytopénie. Un excès deplaquettes sappelle une thrombocytose.   c) Dosage du facteur Willebrand Cet examen est important. Il existe deux méthodes de dosage du facteurWillebrand :- une méthode immunologique qui quantifie le facteurWillebrand par son antigénicité. On parle alors de mesure du vWF: Ag- une méthode fonctionnelle qui quantifie le facteurWillebrand par son activité cofacteur de la ristocétine. La ristocétine est unantibiotique non utilisé en thérapeutique qui entraîne une agrégation desplaquettes en présence de facteur Willebrand. On parle de mesure du vWF: RCo.En clinique, létude du "complexe Willebrand" doit comportersystématiquement un dosage de lactivité coagulante du facteur VIII(FVIII :C), du vWF : RCo, du vWF : Ag   d) Autrestests permettant de dépister les anomalies de lhémostase primaire - Test de la consommation de laprothrombineCe test ancien a encore une grande utilité pratique. Il consiste àmesurer la prothrombine résiduelle dans le sérum. Il est altéré en cas dethrombopathie ou de maladie de Willebrand.   -Le temps d’occlusion plaquettaire (TOP), réalisé avec un appareil spécifique(le PFA100®) est un test global d’hémostase primaire très sensible auxmaladies de Willebrand qui peut être utilisé da,s le dépistage de cette maladieou de certaines thrombopathies.  Certains tests sont tombés en désuétude :   -Signe du lacet : Test peu reproductible et peu informatif. Une compression veineuse ouune dépression cutanée entraîne la formation de pétéchies. On parle du signe dulacet positif. Ceci peut être la traduction dune thrombopénie, dunethrombopathie ou dune fragilité vasculaire.   -Rétraction du caillot : Lorsquon laisse au bain-marie un caillot sanguin dans son sérum, il serétracte. Cette rétraction est due à la présence de plaquettes. La rétractionest insuffisante en cas de thrombopénie ou de thrombopathie.   e) Testsspécialisés    - Etude des fonctions plaquettaires par agrégométrie photométriqueDans certains cas il est nécessaire pour étudier les fonctionsplaquettaires davoir recours à des tests in-vitro qui sont du ressort dulaboratoire spécialisé. Le test de référence est lagrégométrie qui consiste àétudier les courbes dagrégation plaquettaire en présence dinducteursdagrégation : ADP, collagène, ristocétine, thrombine, acide arachidonique,ionophore calcique.   -Etude des récepteurs membranaires  par cytométrie en fluxLa cytométrie en flux est une technique permettant de compter certainescellules après les avoir marquées avec des anticorps spécifiques. Desdéveloppements modernes très intéressants sont en cours dans lutilisation dela cytométrie pour  létude des plaquettes.  2 - Tests explorant la coagulation (Tab. 2, Fig. 9A et 9B) a) Temps de céphaline + activateur : TCA Cet examen consiste à activer la voie intrinsèque de la coagulation pardifférentes substances : le Kaolin (TCK = Temps de Céphaline Kaolin),  ouplus souvent la silice micronisée ou lacide ellagique. Dans ce test, lacéphaline est un phospholipide qui remplace les plaquettes. Le TCA nest doncpas modifié en cas de thrombopénie ou de thrombopathie. Chez ladulte, la valeur normale moyenne du TCA est de 30 à 34 sechabituellement. Un laboratoire doit donc toujours rendre un temps témoinpour permettre l’interprétation du test. On considère que le TCA est anormal lorsque le rapport temps dumalade/temps du témoin est supérieur à 1,2. Chezlenfant on admet  que le Temps de Céphaline Activée est plus long : lerapport de coagulation est de 1,3.   Pour que le Temps de Céphaline Activé soit normal, il faut que lesfacteurs suivants soient normaux : facteur du système contact (facteur XIIet XI, kininogène de haut poids moléculaire, prékallicréine), complexe antihémophilique (facteur IX, facteur VIII), complexe de la prothrombinase (facteurX, facteur V) prothrombine (facteur II), fibrinogène (facteur I). b) Temps de Quick  Cet examen consiste à mesurer le temps que met à se former un caillotde fibrine lorsquon ajoute dans le plasma un excès de thromboplastine oufacteur tissulaire. Normalement le caillot se forme en 12 à 13 sec cequi représente le temps de Quick. Il est habituel (et regrettable) dexprimer le temps de Quick enpourcentage. Ceci sappelle alors Taux de Prothrombine (TP: le terme estimpropre car il ne reflète pas seulement les variations de la prothrombine).  Le temps de Quick est anormal si le rapport : [Temps de Quick dumalade / Temps de Quick du témoin] est supérieur à 1,2.Le temps de Quick explore les facteurs suivants: facteur VII, facteurX, facteur V, facteur II, fibrinogène. c) Dosage du fibrinogène  Cet examen est fait très fréquemment car les anomalies peuvent êtreresponsables de troubles graves de la coagulation (syndrome de défibrination).Certaines anomalies sont acquises (coagulation intra-vasculaire disséminée:CIVD), dautres sont congénitales (afibrinogénémie congénitale). Dans certainscas, on trouve aussi des fibrinogènes anormaux cest-à-dire présents mais defaible qualité fonctionnelle: dysfibrinogénémie. Le taux normal de fibrinogèneest de 1,8 à 4 g/l.d) Tests plus spécialisés: dosages séparés desfacteurs de la coagulation Il est possible de doser individuellement chacun des facteurs de lacoagulation: par exemple : dosage du facteur VIII, dosage du facteur IXpermettant le diagnostic de lhémophilie. Un examen de laboratoire fréquemment demandé est le dosage desfacteurs du complexe prothrombinique. Lorsque ce dosage est demandé, lelaboratoire dose les facteurs II, V , VII, X. Cet examen est de grand intérêtdans le diagnostic  des insuffisances hépato-cellulaires et deshypovitaminoses K (facteur V normal). e) Méthode fonctionnelle- méthode antigénique La quasi totalité des tests utilisés en coagulation explore lespropriétés fonctionnelles des facteurs de coagulation. On mesure donc desactivités en première intention. Dans certaines circonstances, notamment quandlactivité est diminuée, on est amené à doser par méthode immunologique lesfacteurs de coagulation. La méthode immunologique renseigne sur la présence etla quantité de facteur, mais non sur sa valeur fonctionnelle. Ceci explique quelon définisse pour un même facteur deux valeurs différentes :- La méthode fonctionnelle, le facteur est désigné par la lettre "C" Exemple: facteurIX :C ou facteur IX coagulant. Ce dosage peut être fait par une méthode decoagulation: dosage chronométrique, ou à laide de substrat biochimique :dosage chromogénique ou colorimétrique.- La méthode immunologique: le facteur est désigné par les lettres "Ag". Exemple :facteur IX :Ag ou facteur IX antigène. Si un facteur est présent mais anormal (anomalie qualitative), on peutvoir une discordance entre le dosage antigénique normal et un dosagefonctionnel perturbé. f) Dosage des inhibiteurs de la coagulation De plus en plus souvent en pathologie on estamené à doser les inhibiteurs de la coagulation pour essayer de comprendre laraison de thromboses à répétition.Tous les inhibiteurs peuvent être dosés par méthode fonctionnelle ouantigénique : antithrombine, protéine C, protéine S.On peut aussi essayer de savoir si le patient réagit normalement à laprotéine C activée. Ce test appelé recherche de résistance à la protéine Cactivée sexprime en ratio. Chez le sujet normal, il est supérieur à unevaleur voisine de 2,3. Ce chiffre dépend en fait de la méthode utilisée, lesnormes étant définies par chaque laboratoire en fonction de sa technique(réactifs et automates). g) Etude en biologie moléculaire Le développement des techniques de biologie moléculaire a permis de mieuxcomprendre certains déficits de la coagulation et parfois den faire lediagnostic.Les principales applications de la biologie moléculaire sont : - La recherche de mutations responsables dhémophilieA ou B. Ceci peut permettre le diagnostic de conductrice dhémophilie ou undiagnostic anténatal.- La recherche de la mutation responsable de laRésistance à la Protéine C Activée (R506Q ou facteur V Leiden).- La recherche de polymorphisme 20210 A sur le gènede la prothrombine : anomalie plus récemment mise en évidence considérée commeun facteur de risque de thrombose veineuse pour laquelle il n’existe pas detest de dépistage par méthode de coagulation. Le diagnostic fait doncdirectement appel à la biologie moléculaire. 3 - Tests explorant la fibrinolyse  a) Temps de lyse des euglobulines (TLE ou test de Von Kaulla)Cet examen de base permet de dépister lesfibrinolyses excessives : on forme un caillot deuglobulines. Celui-ci se lysespontanément en 90 mn. Un raccourcissement important (une demi-heure voire unquart dheure du temps de lyse des euglobuline) témoigne dunehyperfibrinolyse.Il est possible de doser de façon spécifiqueles activateurs du plasminogène, le t-PA, lu-PA et les inhibiteurs (PAI-1, PAI-2). b) Dosage du plasminogène sanguinCe dosage na pas un grand intérêt. Il semble que certains déficits enplasminogène puissent être associés à des thromboses. c) Produit de dégradation du fibrinogène etD-DimèresLaction de la plasmine sur la fibrine entraîne la formation de PDF(Produit de Dégradation de la Fibrine et du fibrinogène). Cet examen nest doncpas spécifique puisquil ne différencie pas la dégradation du fibrinogène decelle de la fibrine. Cest la raison pour laquelle il a été remplacé par ledosage des D-Dimères : les D-Dimères sont des produits de dégradationspécifique de la fibrine. Ils sont positifs donc sil y a activation de lacoagulation et de la fibrinolyse.Le dosage des D-Dimères est utilisé en pathologie, dans le diagnosticdexclusion des thromboses veineuses profondes et d’embolie pulmonaire. Ils ontune très bonne valeur prédictive négative: un patient pour lequel les D-Dimèressont négatifs avec une technique sensible (ELISA) n’a pas de thromboseveineuse (sensibilité >95%).  Paramètre  Valeurde référence  Anormalsi   TCa  30-36s  M> 1,2 x T ( 1,3 x T chez enfant)TQ (TP)  12-13s (70-150%)  M> 1,2 x T  (1,3 x T chez enfant)Fibrinogène  1,8- 4 g/l  Hors-normes  Facteurs coag  60 - 150%  60% F Willebrand  50-150%  Fonctiondu groupe sanguin  TS (Ivy)  4à 8 mn  >10 mn (nbreuses causes d’erreur)TLE    >2 heures  1h 30AT, PC, PS  60-150 %  Hors-normesRPCA  Ratio>2,3   RatioD-Dimères latex  Neg  Positivité,exprimée en +, ++, +++D-Dimères ELISA  400 ng/ml  HorsnormesComplexes solubles  Négatifs  Positivité,exprimée en +, ++, +++ Tableau2 : Valeurs normales des tests de coagulationFig9A : Schéma simplifié d’activation de la coagulation in vitro  Fig9B : Schéma de la coagulation in vitro- Letemps de céphaline + activateur explore la voie intrinsèque(partiegauche: F XII, XI, IX, VIII, X, V, II, I)- Letemps de Quick explore la voie extrinsèque(partie droite: F VII, X, V, II, I)II - APPLICATIONSDES TESTS DHEMOSTASE 1 - Dépistage du risque hémorragique   Ledépistage du risque hémorragique ne fait pas appel aux tests dhémostase. Lexamen le plus sensible pour dépister un risque hémorragique enparticulier en pré-opératoire est linterrogatoire qui doit êtreparticulièrement soigneux : recherche dantécédents hémorragiques personnels etfamiliaux, de signes hémorragiques même discrets: gingivorragie, ménorragie,épistaxis, ecchymose spontanée, saignement prolongé lors des piqûres ou descoupures, saignement prolongé après petit geste chirurgical ou des extractionsdentaires...  Danscertains cas linterrogatoire nest pas possible ou insuffisant : patientinconscient ou répondant mal aux questions, enfants... On est alors amené àpasser directement à la deuxième étape : tests biologiques pour diagnostic desyndrome hémorragique.  2 - Tests dhémostase pour le diagnostic de syndrome hémorragique Les examens de base nécessaires : numérationplaquettaire, temps de Quick, temps de céphaline + activateur. Les principales orientations fournies par ces tests dhémostase sontles suivantes:   a) Thrombopénie Après avoir éliminé une fausse thrombopénie, le problème est de savoirsil sagit dune thrombopénie centrale (due à une anomalie de la moelleosseuse), ou périphérique: la moelle osseuse fonctionne bien mais lesplaquettes sont détruites séquestrées ou consommées (cf. cours dhématologieclinique). b)  TCA normal + Temps de Quick allongé Il sagit habituellement dun déficit en facteur VII qui peut êtrecongénital ou acquis c) TCA allongé + Temps de Quick normal - Hémophilie A et B surtout- Ne pas oublier que dans la maladie de Willebrand,le FVIII est souvent diminué-  Déficit en facteur XI(hémorragique dans 1/3 des cas environ)- Les autres anomalies responsables dallongementisolé du TCA ne sont habituellement pas hémorragiques: il sagit surtout desanomalies du système contact, et des anticoagulants circulants de type lupiqueou lupus anticoagulant (anticorps antiphospholipides dirigés contre lessupports phospholipidiques des réactions de coagulation).     Tableau3 : Diagnostic d’un allongement isolé du Temps de Quick (TQ) oudu temps de céphaline + activateur (TCA)    d) TCA allongé + Temps de Quick allongé  Il s’agit le plus souvent d’une anomalie d’un des facteurs explorésconjointement par le TCA et le TQ (facteurs du complexe prothrombinique et/oule fibrinogène). Le 1er test à réaliser est le dosage dufibrinogène.   - Labaisse du taux de fibrinogène (. congénitale: afibrinogénémie,hypofibrinogénémie, dysfibrinogénémie. acquise: CIVD,fibrinolyse aiguë. On effectuera alors des analyses plus spécilaisée explorantla fibrinolyse comme le dosage des D-Dimères et le temps de lyse deseuglobulines (cf cours d’hématologie clinique)   - Encas de fibrinogène normal ou modérément abaissé (> 1g/l) on s’orienteraplutôt vers des déficits combinés en facteurs et plus particulièrement lesfacteurs du complexe prothrombinique. Il faut demander le dosage séparé desfacteurs VII, X, V et II. Les déficits isolés en facteur II, V, et X allongentle temps de Quick et le TCa. En outre ces examens mettent en évidence lesdéficits combinés présents dans les insuffisances hépato-cellulaires et leshypovitaminoses K (tableau 4).                                   Tableau4 : Diagnostic d’un allongement du temps de Quick   etdu temps de céphaline + activateur    - Devant un syndrome hémorragique même fruste associé à unenumération plaquettaire normale, un dosage fibrinogène, un Temps de CéphalineActivé et un temps de Quick normaux, il faut doser le facteur Willebrand.Ce dosage doit être associé à un dosage du facteur VIII. Dans 10 à 20 % des casde maladie de Willebrand modérée, le TCA est normal. Si dans cette circonstance le complexe Willebrand est normal, on arecours aux examens spécialisés plaquettaires pour rechercher une anomaliefonctionnelle (test dagrégation plaquettaire). Tableau5 : exploration d’un syndrome hémorragique   3 - Test dhémostase pour bilan de thromboses veineuses récidivantes : L’exploration doit être faite à distance du dernier épisodethrombotique et si possible en l’absence de traitement anticoagulant. On dose alors lantithrombine, la protéine C, la protéine S et on faitune recherche de résistance à la protéine C activée et de lupus anticoagulant(éventuellement associée à la recherche d’anticorps antiphospholipides). 
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